فهرست مطالب

پيشگفتار : 3

1-1 : روش كلي مورد استفاده در HBOI : 9

2- جمع آوري و ذخيرة ارگانيسم هاي آبزي . 11

1-2 ـ كنترل ارگانيسم هاي آبزي : 11

2-2 :جمع آوري : 13

3-2 : ذخيرة ارگانيسم هاي آبزي : 19

3- استخراج 20

1-3 : بي مهرگان :‌ 20

2-3 : جلبك هاي بزرگ : 22

3-3 – طرح روند مورد استفاده در آزمايشگاه .مؤلف در HBOI : 23

برنامه ريزي براي روش جداسازي : 24

1-4 – طرح هاي تقسيم : 25

2ـ4 : استخراج فاز جامد : 27

3ـ 4 : بيولوتوگرافي : 28

5: كروماتوگرافي ستون : 29

4ـ اثر پردازش پايين رود : 71

1-5 – داده هاي اوليه : 73

2-5 – محصولات درون سلولي : 74

3-5 : توليدات خارج سلولي : 76

4-5 : خالص سازي محصول : 78

6 خلاصة بحث : 82

1- دنبال كردن جداسازي محصولات طبيعي : 83

استخراج بيشتر :‌ 84

2-2: شناسايي شيميايي : 85

3-2 : اسپكترومتري جرمي و Lc-Ms   : 86

4-2 : جداسازي كامل : 86

1-4 : جهش يافته هاي بيوسنتزي : 91

1-1-4 : جهش يافته هاي بيوسنتزي پراديميسين : 92

3-1-4 : آنالوگ هاي تريكوتسين : 93

2-4 : بازدارنده هاي آنزيم : 94

2-5 : روش شناسي : 97

2-2-5: تحليل محصولات بيوسنتز مستقيم : 98

3-5 : بيوسنتز پيش ماده اي اسكوآلستاتين ها : 99

1-3-5: روش : 102

1-4-5 : A54745  : 106

2-4-5 : ميتومايسين ها : 106

5-4-5: تغذيه پيش ماده هاي طبيعي : 108

6-4-5: هالوژناسيون : 108

6- تغيير شكل زيستي : 109

1-1-6 : چه چيز بايد تغذيه شود: 111

2-1-6: ارگانيسم ها : 112

3-1-6: شرايط تغذيه : 114

4-1-6: عوامل ديگر : 117

پيشگفتار :

اقيانوس ها در جهان بيش از 70% سطح زمين را مي پوشانند و داراي بيش از 200000 بي بهره و گونه هاي جلبكي هستند . اين ارگانيسم ها در جوامع پيچيده و در ارتباط نزديك با ديگر ارگانيسم ها زندگي مي كنند . چه به صورت ارگانيسم هاي ماكرو ( مانند جلبك ، اسفنج ، نرم  تنان پوشش دار و يا به صورت ميكرو ( مانند باكتريهاي غيررشته اي ، قارچ ها و آكتينوفايست ). بعضي از ارگانيسم ها مواد شيميايي خود را از منابع غذايي به دست ‚ي آورند اگر چه مابقي آنها تركيبات را دوباره سنتز مي كنند . بعضي از تركيبات ي توانند توسط ميكرو ارگانيسم هاي مربوطه توليد شوند در حالي كه مابقي آنها جهت توليد به يك ارتباط بين ميزبان و ميكرو ارگانيسم نياز دارند . مواد شيميايي يك نمونة خاص مي توانند تحت تأثير زيستگاه و عوامل فصلي و جغرافيايي باشد. در حقيقت منشاء واقعي بيوژنتيكي سنتز محصولات طبيعي آبزي ـ در جامعة اين محصولات يك موضوع مورد بحث است.

به علت تنوع ارگانيسم هاي آبزي و زيستگاهها ، توليدات آبزي طبيعي طبقات شيميايي زيادي را احاطه مي كنند ( مانند ترين ها ) شيميكيمات ها  ، پلي كتيو ها ، استوژنين ها ، پيتيدها، آلكالوئيدهاي ساختارهاي متفاوت و يك دامنه اي از تركيبات بيوسنتز مخلوط ، در دهة گذشته به تنهايي ، ساختارهاي بيش از 500 محصول طبيعي دريايي به چاپ رسيده اند.

در بسياري از موارد طبقة تركيب موجود در ارگانيسم مي تواند بر اساس طبقه بندي ارگانيسم منبع پيش بيني شود . متأسفانه حتي  شناخت علم به طبقة تركيب هميشه ما را در جهت تعيين يك ساز خالص سازي هدايت نمي كند . مجموعه هايي از محصولات طبيعي آبزي مي توانند داراي چندين عامل شيميايي باشند ( مانند oso3 – Na – Oac – och3 – oh ) . هرگونه تغيير در عامل مي تواند تغيير اساسي در قطبيت تركيبات ايجاد كند بنابراين روش مورد نياز براي خاص سازي نيز تغيير خواهد يافت . به عنوان مثال نمونه هاي اسفنج ته دريايي با جنس Spomhosorites داراي آبيس ( ايندول ) آلكالوئيد است. تاپستين ( طرح 1 ) ، ساده ترين تركيب اين مجموعه ميتواند با كروماتوگرافي هر ژل سيليكا با استفاده از مخلوطهاي ckcl3  – Meoh به عنوان شوينده ، خالص گردد . در الگاسيدين  d ( طرح 2 ) ك داراي يك زنجيرة جانبي . 2- آمينو ايميدازول است كه خيلي قطبي تر است وبه كروماتوگرافي بر فاز ثابت فاز معكوس و شسشه شدن با مخلوطهاي اسيد استونيتريل ـ آب ـ تري فلوئرواستيك ( TFA )  نياز دارد . دراين حالت علم به طبقة ارگانيسم مي تواند  در تعيين ساختار تركيبات خالص كمك كند ولي در تعيين روش عالص سازي براي متابوليست قطبي تر كه داراي يك عامليت شميايي غير منتظره است كمكي نمي كند.

به منظور دسترسي به بينشي در مورد روش هايي كه بيشتر در خالص سازي محصولات طبيعي آبزي استفاده مي شوند 115 گزارش از اين محصولات كه در سال 1995 در روزنامة انجمن شميمدانان آمريكا ، روزنامة شيمي آلي ، تتراهدرون و روزنامة محصولات طبيعي به چاپ رسيده بودند مورد بررسي قرار گرفتند . هر نشريه به طريق زير طبقه بندي مي شود:

1- شاخه ارگانيسم منبع .

2- طبقة تركيبات شيميايي گزارش شده.

3- روش حفظ ارگانيسم ( تازه / منحصر در مقابل خشك فريز كردن ) .

4- روش استخراج “ غير قطبي ” حلال هايي مانند : CH2, CL2  ، هگزان ها ، استون ، ETAO 2 ، Eto2  ، تولئون ، اترنفت ؛ “ غير قطبي و الكل ” هر يك از مواد فوق مخلوط با يك الكل ؛ “ الكل ” معمولاً اتانول ، متانول ، و يا ايزوپروپانول ؛ “ طرح پيچيده ” ؛ مانند استخراج متوالي و يا مخلوطهاي غير معمول خيلي پيچيدة حلالها با “ آبي ”  100% آب يا مخلوطهاي آب ديگر محلولها در حالي كه آب بيش از 50% مخلوط را شامل باشد .

5- روش مورد استفادة تقسيم حلال در صورت وجود اين روش ها به طبقات زير تقسيم مي شوند :

الف ـ “ ساده ” مانند يك تقسيم تك مرحله اي ( مثل يوتانول ـ آب ) و يا تقسيم دو مرحله اي مانند ETOAC ـ آب ) و به دنبال آن تقسيم بعدي فاز آبي با يوتانول.

ب) “ كوپكان ” شامل هر طرح واقعي ويا تغيير يافتة كوپكان ( Kypchan ) كه در آن درصد فاز آبي به طور متوالي تنظيم مي شود.

ج ) “ پيچيده ” ( كمپكس ) : شامل هر طرحي كه در آن يك توالي غير معمول حلال ها و يا مخلوطهاي كمپكس غير معمول حلال ها استفاده مي شوند مانند :

مخلوطهاي هيپتان : ETOA : MEOH : CHCL3  : ACOH

كه در جدا سازي با تزليوين ها استفاده مي شوند.

6- نوع كروماتوگرافي ستون باز ، درخششي ويا ستون خلاء. اين ها به ژل سيليكا ، فازهاي پيوندي ( مانند  CN,Did, C-8 DDS ) ويا نفوذ ژل بر رزين هاي غير عاملي تقسيم مي شوند من جمله سيستم هاي كروماتوگرافي تقسيم و اندازه ه مانند ( SephadenLH- 20 ، SephadenLh- 60  ، Nsbels ، Bibeadssx-20 ، Sn-8 , sn-4 ، AMBERLIT EXAD – 2 ، XAD ، XAD- 7 ، ژل TSK- G3…S ) .

7- نوع روش HPLC مورد استفاده در صورت وجود ـ اين ها به فاز طبيعي ،‌فاز معكوس ( C-18 , C – 8, C-4 ) ديگر فازهاي پيوندي مانند : ( NH2 , CN, DIOL ) ومواردي تقسيم مي شوند كه در آنها تركيباتي از مثالهاي فوق استفاده گردند.

8- كروماتوگرافي مايع فشار مياني ( MPLc ) ، كروماتوگرافي جريان مخالف ( CCC ) ، و كروماتوگرافي لاية نازك تداركاتي ( PILC )كدام يك استفاده مي شوند.

9- آيا هر يك از روش هاي ديگر نيز استفاده مي شوند ( مانند  ترم سازي و بلور سازي ، تبادل آنيون / كاتيون ، فراصافي ) .

نتايج اين بررسي در جداول 3-1 ارائه شده اند . جدول 1 : توزيع تركيبات را در شاخه ها نشان مي دهد.

جدول 2 – رايج ترين روش هاي خالص سازي شاخه هاي متفاوت رانشان مي دهد . جدول 3 – رايج ترين روش هاي خالص سازي را  براي طبقات تركيبات نشان مي دد. تعدادي از نتايج حاصل عبارتند از :

1- نگهداري نمونه ها :

در 77 % گزارشات مواد تازه و منجمد استخراج شدند در 23 % گزارشات از ارگانيسم قبل از استخراج خشك فريز شد و يا در هوا خشك گرديد.( دو نمونه ) .

2- استخراج :

رايج ترين حلال هاي استخراج عبارت بودند از الكل ها ( 46 % ) و يا مخلوطهاي الكل و حلال هاي كم قطبي تر ( 25 % ) .

3- تقسيم سازي :

هيچ تقسيم حلالي در 28 % موارد استفاده نشد تقسيم هاي ساده در 41 % زمان انجام شدند. طرح هاي كوپكان ( kychan ) در 25 % زمان و طرح هاي كمپكس در 50 % زمان استفاده شدند.

4- كروماتوگرافي ستوني ( VCC ) ، درخششي ؤ و يا جاذبة باز ) :

الف ) در 10 % روندهاي جداسازي از هيچ شكلي از كروماتوگرافي ستون باز استفاده نشد.

ب) در 65 % جداسازيها از فازهاي ثابت ژل سيليكا استفاده شد.

ج ) در 12 % جداسازيها از فازهاي ثابت فاز پيوندي ( مانند CN1, DIOL , ODS ) استفاده شد .

د) در 10 % جداسازيها ازفازهاي ثابت ،‌فاز پيوندي و ژل سيليكا استفاده شد( يعني مراحل چندگانه كروماتوگرافي ستوني استفاده گرديد ) .

ذ ) در 46 % جداسازيها از كروماتوگرافي تراوش ژل بر رزين هاي غير عاملي استفاده شد. LH – 20  در 42 % جداسازيها استفاده گرديد .

ر) در 44 % جداسازيها فقط فازهاي ثابت ، فاز معكوس و يا سيليكا استفاده شد ( بدون كروماتوگرافي )

ز) در 13 % جداسازيها فقط از رزين هاي غير عاملي استفاده شد مانند Sephadeax Lh – 20 ،

خ ) در 33 % جداسازيها از تركيب كروماتوگرافي فاز پيوندي و ياسيليكا وكروماتوگرافي بر رزين هاي غير عاملي استفاده شد.

5- MPLC  در 90 % مطالعات استفاده شد.

6- CCC در 70 % مطالعات استفاده شد .

7- PTLC  در 10 % مطالعات استفاده شد.

8- HPLC :

الف ) در 27 % جداسازيها از HPLC  استفاده نشد.

ب) در 60 % فقط فازهاي ثابت فاز نرمال استفاده شد . ( مانندسيليكا ) .

ج ) در 49 % فازهاي ثابت ، فاز معكوس استفاده  شد. (PR-18, PR-8, PR-4 )

د) در 10 % جداسازيهاي چندگانه HPLC  بر فازهاي ثابت ، فاز معكوس و طبيعي استفاده شد.

ذ) در 3 % ديگر فازهاي پيوندي استفاده شدند . ( NH2 , DIOL , CN ).

ر) در 14 % مطالعات از ديگر روش هاي جداسازي استفاده شد مانند فرم سازي ، بلورسازي ، فراصافي و يا كروماتوگرافي تبادل آنيون / كاتيون .

1-1 : روش كلي مورد استفاده در HBOI :

اين فصل يك طرح كلي است از روش كلي مورد استفاده در آزمايشگاه  مؤلف جهت خالص سازي كردن محصولات طبيعي دريايي. يك طرح در شكل 1 آمده است . در روش ها تمام جداسازيها در يك مقياس كوچك انجام مي شوند تا اين كه تركيب خالص به طور تكرار پذير جدا شود. تعدادي روش خالص سازي براي تضمين جداسازي مقام تركيبات مورد نظر استفاده مي شوند و مقام اجزاء يا سنجض زيستي ، ILC-  و يا HPLC ، NMR شناسايي مي گردند . روند كلي ما شامل مراحل زير است :

1- جمع آوري و شناسايي ميداني ارگانيسم آبزي.

2- استخراج اولية ارگانيسم .

3- سنجش يبولوژيكي عصارة اسخراجي.

4- تقسيم جهت تأييد و غني كردن فعاليت زيستي .

5- تعيين قطبيت محصولات طبيعي موجود در عصارة و يا derplicatixn تركيبات معلوم.

6- انتخاب اولين مرحلة كروماتوگرافيك بر اساس قطبيت.

7- كروماتوگرافي بيشتر.

8- توسعة جداسازي يك HPLC درصورت امكان .

9- افزايش مقياس جداسازي براي آزمايش بيشتر بيولوژيكي و يا تشخيص ساختار.

2- جمع آوري و ذخيرة ارگانيسم هاي آبزي .

1-2 ـ كنترل ارگانيسم هاي آبزي :

ارگانيسم هاي آبزي منبع هزاران محصول طبيعي مختلف هستند . بسياري از اين تركيبات در سيستم هاي پستانداران بي نهايت سعي بوده اند. به عنوان مثال پالي توكسين كه در ابتدا در زوآنتيد Palythoa  toxica يافت شد يكي از مهمترين تركيبات غير پروتئيني كشف شد تا امروز مي باشد . حوض جزر ومدي كه در آن زوآنتيد رشد مي كند در شرحهاي اوليه سعي تشخيص داده شد و دانشمنداني كه با آن ارگانيسم كار مي كردند بيمار شدند وعلائم شبيه آنفلونزا در طي مرحلة جمع آوري وكارهاي بعدي ديده شد.ديگر تركيبات مانند ميكا لامبد وآپلي سياتوكسين بي نهايت مشكل ساز بودند آپلي سياتوكسين همچنين داراي ويژگيهاي قوي توسعه دهندة توموري است. به طور كل هنگام كار با هر ارگانيسم جديد ايمن تر آناست كه فرض كنيم مقدار دقيق تركيبات آبزي بايد احتياط و دقت كافي مبذول شود . وسيلة محافظي مناسب ماننذ دستكش و ياحفاظ چشم بايدهميشه استفاده شود. بسياري از محققان ( مانند خود مؤلف) مواردي از ناراحتي شديد چشم داشته اندكه در كلي جمع آوري ارگانيسم ها به وجود آمده بود اين در حالي بود كه هيدروژنها واسفنج هايي مانند : Tedania   ignis    , VeoF : bularia  heitangere داراي مؤلفه هاي آزار دهندة زيادي هستند كه باعث خارش و تشكيل دانه در بعضي افراد مي گردند. به طور نمونه يك رويارويي با اسفنج NEOF : bularia  به تنهايي مي تواند محققاني را كه در آزمايشگاه مؤلف كار مي كنند بر آن دارد تا همگام كار يا نمونه ها از دستكش استفاده كنند . قوياً توصيه مي شود كه هنگام شنا و استفاده از لولة مخصوص تنفس يراي ارگانيسم ها از دستكش مناسب استفاده شود.